最近一直在做糖尿病肾病基底膜PAS染色切片可结果总不尽人意。要么整张切片泛红、背景杂质重根本分不清阳性区域要么整体着色太浅基底膜和细胞膜边界模糊完全没法判读。明明都是按标准流程一步步操作可镜下观察总是出问题。后来查了不少文献也请教了师兄师姐才发现染色翻车未必是染液本身的问题更多是出在组织固定、脱蜡、氧化、梯度水洗这些细节步骤里。其实做PAS染色遇到异常没必要一上来就换试剂、盲目改孵育时间。更靠谱的做法是先根据镜下的染色表现判定故障类型再一步步逐项溯源排查诱因。我把这段时间实操总结的PAS染色常见翻车问题和对应解决办法整理好了分享给做病理的小伙伴们参考。觉得实用的话完全可以存下来或是打印贴在冰箱上随时对照避坑。一、出问题后先看对照别一上来就改参数当PAS染色结果出现异常时我们首先要做的不是换试剂也不是调整时间而是要先看阳性对照的染色情况。如果阳性对照也异常那可能是染色体系存在问题我们需要优先查看过碘酸、Schiff等试剂是否过期、颜色是否正常然后再核查水洗、复染等过程是否存在问题。如果阳性对照正常但染色背景普遍偏深这时我们就要重点排查切片厚度、脱蜡水化程度及水洗、Schiff反应的时间了。如果阳性对照正常而实验样本异常我们要重点检查样本的取材位置、固定方式、糖原或黏液阳性物质含量等过程了。所以我们要先把问题分清楚才能避免后面的调整不会变成“盲改”。二、PAS染色异常快速排查表建议大家先收藏这张表格。下次遇到颜色浅、背景深、染色不均、掉片等问题时可以按照此表进行排查。三、染色浅要先考虑氧化时间我们常说的PAS染色颜色浅是指本应紫红色的基底膜、黏液、糖原或真菌细胞壁只呈现出淡淡的粉红色甚至看不见。遇到这种情况我们可能会一上来就怀疑Schiff染液失效了直接将反应时间延长10min。但是这样做有点“简单粗暴”了。我们知道造成染色弱的原因有3个氧化不足、Schiff活性差以及样本本身问题。所以排查思路应先看阳性对照的结果如果其同样浅则优先排查氧化和染色过程。如果阳性对照正常则要重点查样本阳性物质含量、取材、固定这些因素了。在排查染色过程时我们需要先查看过碘酸和Schiff试剂是否过期、变质。Schiff需要避光保存且在使用前要恢复到室温。过碘酸将糖类结构氧化出醛基是PAS染色的关键氧化时间不足、过碘酸浓度过低都会影响染色结果。我们一般使用1%高碘酸氧化15min。四、背景深先排查水洗操作理想的PAS切片应该是阳性物质清晰、背景干净、层次分明但是我们的切片常常会“红的发紫”阳性物质和周围组织没有“边界”背景一塌糊涂。五、染色不均重点查是否干片你们是否碰到过这样的切片呢同一张切片边缘颜色深、中间浅或者局部颜色深浅不一拍照时难选择合适的视野。遇到这种切片我们可以按照下面的表格逐一排查六、染色浅苏木素复染别超过2分钟正常的PAS染色结果呈紫红色但是现在的切片整体偏蓝紫色阳性物质不突出。这时需要我们进行如下的排查复染整个过程时间较短我们在操作时不应照搬别人的时间。因为不同实验室用的苏木素品牌、浓度不同染色强度存在差异我们应该先做预实验摸索适合自己的染色时间。七、切片脱落先看烤片过程是否达标在染色过程中我们最担心的事情就是出现组织卷边、破碎甚至脱落。好不容易完成取材和切片却在染色时掉片了。频繁掉片建议先查一下烤片操作。常规石蜡切片需要在60℃烤片30-60min。易脱组织可延长至1-2h但不建议长时间高温处理以免影响组织结构。切片的厚度也是需要考虑的常规切片为3-5μm。此外水洗的方式也很关键。流水不要直接冲击组织区域应该让水流沿着玻片边缘缓慢流下。同时也可以使用防脱载玻片。八、对照正常但样本不显色别再反复换试剂我们是否也碰到这样的情况呢同一批的切片中阳性对照染色结果很好但实验样本不显色或明显弱于预期。这说明染色体系大概率是不存在问题的更换Schiff试剂、延长氧化时间是解决不了问题的。这时我们需要确认样本阳性物质含量是否本就较低、取材是否包含目标区域、固定过程中是否造成阳性物质流失糖原、黏液等受取材时间、代谢状态和固定方式影响较大。样本前处理不稳定后面染色再标准也可能看不到理想结果。结语总之PAS染色异常时比较忌讳的做法是颜色浅延长染色时间背景深就随便缩短时间。我们应该采用更稳妥的思路解决问题先看对照再找问题缩小参数调整范围。如果你的实验室刚好有人也要做PAS染色实验可以把文中的排查表发给他。有备无患当结果出现异常时能够快速找到原因解决问题。