卡梅德生物技术快报｜ChIP 实验技术手册：X-ChIP 与 ULI-NChIP 完整操作流程 + 参数配置

摘要本文基于植物学权威方法文献整理染色质免疫共沉淀ChIP标准化实验流程包含 X-ChIP交联与 ULI-NChIP超微量非交联两种方案详细给出缓冲液配方、实验参数、操作步骤与质控要点适用于植物样本 ChIP-qPCR/ChIP-seq 建库可直接作为实验 SOP 使用。1 技术概述ChIP 是体内检测蛋白 - DNA 相互作用的核心技术分为交联与非交联两类。X-ChIP 适用于转录因子ULI-NChIP 适用于组蛋白修饰与 10³ 细胞级微量样本本文以拟南芥为例提供可复现流程。2 试剂与设备清单2.1 主要试剂蛋白酶抑制剂、PMSF、Protein A/G Dynabeads、RNase A、蛋白酶 K、MNase、固相萃取柱、线性聚丙烯酰胺。2.2 关键设备4℃冷室、高速冷冻离心机、超声破碎仪、磁力架、凝胶电泳仪。3 缓冲液配方直接配置M110 mM PBS (pH7.2)、0.1 M NaCl、10 mM β- 巯基乙醇、1 M 戊二醇、0.1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂现配M2M1 基础上加 10 mM MgCl₂、0.5% Triton X-100现配M3去除 MgCl₂与 Triton 的 M1现配核裂解液50 mM Tris-HCl (pH8.0)、10 mM EDTA、1% SDS、0.1 mM PMSF、2× 蛋白酶抑制剂ChIP 稀释液1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris-HCl (pH8.0)、167 mM NaCl洗涤液低盐 (150 mM NaCl)、高盐 (500 mM NaCl)、氯化锂、TE洗脱液100 mM NaHCO₃、1% SDS4 X-ChIP 完整实验流程SOP4.1 染色质制备1g 植物组织液氮研磨加 35mL M1 涡旋混匀。加 37% 甲醛至终浓度 1%4℃旋转 10min 交联。加 2M 甘氨酸至终浓度 0.125M4℃旋转 10min 终止。4 层滤布过滤1000×g 4℃离心 20min弃上清。M2 洗 2 次M3 洗 1 次离心弃上清。1mL 核裂解液重悬分至 2 管超声破碎。超声参数高功率30s ON/30s OFF6 循环 ×2 组。16000×g 4℃离心 15min取上清留 100μL 为 input。上清用 ChIP 稀释液稀释 3–5 倍。4.2 免疫沉淀100μL 磁珠用 ChIP 稀释液洗 3 次加入样品 4℃预封闭 1h。磁力架去磁珠加 1μg 抗体 4℃旋转过夜。加封闭后磁珠4℃旋转 1h 捕获复合物。依次用低盐、高盐、氯化锂、TE 洗磁珠各 4℃旋转 5min。250μL 洗脱液 65℃孵育 15min 洗脱重复 1 次合并 500μL。加 5M NaCl65℃解交联≥6h。4.3 DNA 纯化加蛋白水解缓冲液45℃孵育 1h加 RNase A 37℃孵育 30min。酚氯仿异戊醇 (25:24:1) 抽提16000×g 离心 5min。加糖原、NaAc、无水乙醇-20℃沉淀 3h。16000×g 离心 20min70% 乙醇洗 2 次晾干100μL 水溶解。5 ULI-NChIP 超微量流程10mg 组织加 30μL Galbraith 缓冲液冰上研磨离心弃上清。50μL 核提取液重悬MNase 稀释至 200U/μL。加 MNase 缓冲液、DTT、酶37℃消化 7.5minEDTA 终止。加去污剂冰上 15min加 ChIP 缓冲液 4℃旋转 1h。取 30μL 为 input磁珠预封闭 2h抗体孵育≥3h过夜结合。低盐、高盐各洗 2 次洗脱、解交联固相萃取柱纯化。乙醇沉淀20μL 洗脱液溶解 DNA。6 关键质控与参数优化片段质控纯化 DNA 电泳呈 200–500bp 弥散带。抗体质控必须使用 ChIP 级抗体设置 IgG 阴性对照。酶切 / 超声质控每次实验需做预实验确定最优条件。温度质控除酶切与解交联外全程 4℃操作。7 下游分析流程靶向验证ChIP-qPCR以 input 为内参计算富集倍数。全基因组分析ChIP-seq 文库构建上机测序call peak 分析。8 总结ChIP 实验的核心是交联适度、片段均一、抗体特异。X-ChIP 适合常规样本转录因子研究ULI-NChIP 适合微量样本与组蛋白修饰。本文流程可直接用于植物样本实验稳定性高、重复性好。参考文献王泓力焦雨铃。染色质免疫共沉淀实验方法 [J]. 植物学报2020, 55 (4): 475-480.