抗原修复Antigen Retrieval, AR技术作为免疫组化IHC实验流程中的简单操作步骤之一于1991年由石善溶教授首次在Journal of Histochemistry Cytochemistry提出。这项将福尔马林固定石蜡切片FFPE进行热处理的简单技术不仅打破了传统蛋白质变性的理论教条更是彻底改变了IHC在病理诊断和生物医学研究中的应用格局。35年来抗原修复技术已从单纯的IHC技术应用到蛋白质提取、分子检测、定量分析及组织蛋白质组学等多种技术平台为精准医疗时代的生物标志物研究奠定了坚实基础。「IHC诊断室」第14期将和大家分享抗原修复技术的发展历程、应用拓展与未来展望。同时我们发出“英雄帖”欢迎小伙伴们投稿。原创文章一经采用必有豪礼相赠。一、AR技术的缘起与突破1.1理论教条的束缚甲醛固定组织后影响染色效果这一难题困扰了免疫组化研究20多年。早期研究者对其机制缺乏了解尝试了多种方法如将组织切片浸泡在含糖、盐或化合物的溶液中或滴加硫酸锌溶液但效果均不理想。后来开发了酶修复石蜡切片技术但因操作复杂难以在应用中推广。当时学术界普遍认为蛋白质在超过60℃的高温下会发生不可逆的变性并丧失抗原活性。这一根深蒂固的理论教条严重限制了研究者的思路。中国学者石善溶教授在1988年开始攻克这一难题首先要解决这一关键问题福尔马林固定对抗原结构的修饰作用是可逆的还是不可逆的如果可逆在什么条件下能修复1.2关键理论的溯源为解决这一问题石善溶教授在缺乏现代互联网检索和在线数据库的条件下花费无数个日夜查阅大量文献最终在图书馆书架顶层尘封已久的杂志合订本中找到了答案。这是Fraenkel-Conrat等人在1947-1948年发表的一系列文章研究表明甲醛与蛋白质之间形成的交联键可通过100℃以上加热或强碱处理被破坏为热诱导抗原修复技术奠定了理论基础。经过实验和研究石善溶教授发现将FFPE组织切片在水中煮沸可显著改善免疫组化染色效果。1.3里程碑意义这一简单而高效的技术迅速获得学界认可2011年石善溶教授因此荣获美国组织化学学会最高奖项——George Gomori奖标志着该技术在组织化学领域的里程碑地位。并且这一技术打破了传统教科书关于蛋白质变性的定义。Ki67等标志物在抗原修复前后的染色差异,充分展示了这一技术的威力。二、AR广泛应用与技术拓展抗原修复技术的价值远不止常规免疫组化实验。经过35年的发展研究人员已将这一技术扩展到多个领域如病理诊断、分子检测、蛋白提取等。在免疫电镜研究中对常规处理的环氧树脂包埋组织超薄切片进行热修复可获得满意的阳性结果。在原位杂交实验中对FFPE进行高温加热可显著提高检测结果。对存档的巴氏涂片进行煮沸修复可获得理想的MIB-1染色用于宫颈癌细胞的精准诊断。2.1诊断病理学的全面渗透抗原修复技术对病理学诊断研究的发展意义重大。AR使经过验证的抗体能够在FFPE样本上获得满意的染色结果并保留形态学为基础和转化研究提供便利。目前该技术已广泛应用于病理学、肿瘤诊断及其他免疫学研究。2.2细胞病理学的突破性应用免疫细胞化学ICC曾因细胞样本量有限、制备方法缺乏标准化及对照样本难获取等因素发展缓慢。随着甲醛固定的风干涂片结合AR处理成为标准化方案ICC结果才更可靠并且因为风干细胞具有更大、更扁平的形态而广泛应用。2.3免疫荧光技术的革新研究发现AR在恢复抗原活性的同时还会减少自发荧光。通过优化修复液种类、加热条件和抗体孵育参数研究人员已成功在FFPE样本上实现多重免疫荧光标记及FISH与IF联合标记为复杂样本的研究提供工具。2.4分子提取与组学研究的桥梁AR技术已成功拓展至核酸、蛋白质提取。基于热诱导修复的DNA提取方案采用NaOH或KOH溶液煮沸处理显著提升了DNA提取的质量。蛋白质提取方面在含2% SDS的缓冲液中煮沸FFPE组织切片已成为标准方案结合高压处理可将蛋白提取率提升80%-95%为组织蛋白质组学研究奠定了基础。2.5质谱成像等前沿应用抗原修复预处理被证实是生成高质量肽质谱成像的关键步骤为分析档案FFPE组织的蛋白质组提供了新途径。可从单个常规FFPE切片中检测数千种蛋白质有利于生物标志物的发现。写在最后抗原修复技术从一项简单的热处理技术发展至今已成为现代病理诊断和生物医学研究不可或缺的基石。为了一个最初的设想研究人员深挖近50年的纸质文章再次证明了坚持的力量。一个小小的技术改动带来了IHC技术的快速发展。对这一技术深入的理解和应用创新将会开辟更加广阔的应用场景。